中井 剛

【目的】cis-Diammine-dichloro-platinum（II）［cis-Pt（II）］は高い抗がん活性を示す一方，厳しい副作用や耐性化が問題となっている。 近年cis-Pt（II）の欠点を克服するプロドラッグとして経口投与可能なPt（IV）化合物が期待されている。Pt（IV）化合物は，生体内還元物 質によりPt（II）へと還元されDNAに対する薬理効果を発揮するが，還元過程で活性酸素種が生成する可能性があり，その影響について 考慮する必要がある。今回，cis-Pt（II）のPt（IV）誘導体であるcis-diammine-tetrachloro-platinum（IV）［cis-Pt（IV）］を用い，各種還 元物質との反応性や活性酸素種の種類およびDNA損傷の有無について検討した。<BR> 【方法】cis-P（t IV）の還元剤としてascorbic acid（AsA）およびglutathione（GSH）を使用した。DNA酸化損傷の指標としてグアニン酸化 体（8-oxodG）を電気化学検出器付HPLCにて定量し，DNA高次構造変化についてはCDスペクトルから評価した。DNA結合性について はethidium bromideによるDNAインターカレーションに対する抑制効果から評価した。水酸基，カルボキシル基あるいはアミノ基を 持つチオール性還元物質についても，上記活性を測定した。<BR> 【結果および考察】cis-Pt（IV）は単独で弱い酸化的DNA損傷性を示し，AsA共存下ではその損傷性が約2倍に増強した。一方，GSHは cis-Pt（IV）が示す損傷性を完全に抑制した。AsA/Pt（IV）共存下で引き起こされる酸化的DNA損傷は，カタラーゼおよびSODにより抑 制されず，ヒドロキシルラジカル（HO・）消去剤であるエタノールおよびDMSOによって用量依存的に抑制された。cis-Pt（IV）はAsA 共存下でcis-Pt （II）と同様のDNA結合性およびDNA高次構造変化を示した。一方，GSHはcis-Pt （II）のDNA結合性およびDNA高次構造 変化を抑制した。以上の結果から，cis-Pt（IV）はAsAにより還元されてcis-Pt（II）様の作用を示し，その過程でHO・を生成することが 明らかとなった。一方，GSHは，種々のチオール性還元物質を用いた検討から，チオール基，アミノ基またはカルボキシル基を介した cis-Pt（II）との錯体形成によりDNA結合を抑制すると考えられる。Pt（IV）化合物の核酸への作用は生体内還元物質により多様に変動す るので，適切な配位子・還元物質の策定によりPt （IV）製剤の有用性を拡大できる可能性がある。

Abstract Platinum(IV) [Pt(IV)] compounds are being developed worldwide as next-generation platinated drugs for a broad range of cancers. Since Pt(IV) compounds show relatively stable structural features, they are applicable for oral administration. The anti-cancer mechanism of Pt(IV) compounds has been proposed as that Pt(II) generated from Pt(IV) by endogenous reductants binds to DNA, resulting in the inhibition of transcription and replication of cancer cells. Here, we investigated the interaction manner between DNA, Pt(IV) and endogenous reductants such as ascorbic acid (AsA) and glutathione (GSH). cis-Diammine-tetrachloro-Pt(IV) [cis-Pt(IV)], which is a prodrug of cisplatin [cis-diammine-dichloro-platinum(II), cis-Pt(II)], was incubated with calf thymus DNA in the presence of AsA or GSH. In the presence of AsA, cis-Pt(IV) induced oxidative damage in calf thymus DNA, in which elevated amount of 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine (8-oxodG), a biomarker for DNA oxidation, was observed. Hydroxyl radical (HO·) scavengers (ethanol and dimethylsulfoxide) suppressed the AsA-associated oxidative damage in a dose-dependent manner, whereas superoxide dismutase and catalase did not, suggesting that HO· was involved in the DNA oxidation. CD spectral change and crosslink formation in calf thymus DNA were also observed during this DNA oxidation, suggesting the cis-Pt(IV) reduction by AsA and the DNA conformational change by cis-Pt(II)-DNA binding. However, GSH did not show any 8-oxodG formation in calf thymus DNA likely due to its own HO· scavenging capability. GSH also suppressed the cis-Pt(II)-like conformational change probably by cis-Pt(II) sequestering from DNA by GSH. This GSH-cis-Pt(II) complex formation was also suggested by agarose gel electrophoresis. In order to reveal the detailed mechanisms of the complex formation, three thiol compounds (2-mercaptoethanol, 2-mercaptoacetic acid, and 2-mercaptoethylamine) were compared with regard to the reductive complex formation capabilities with cis-Pt(II). As observed in GSH-cis-Pt(IV)-DNA system, 2-mercaptoacetic acid and 2-mercaptoethylamine inhibited cis-Pt(II)-induced CD spectral change and crosslink formation in calf thymus DNA, whereas 2-mercaptoethanol did not, suggesting that thiol- and amine-/carbonyl-groups are involved in GSH-cis-Pt(II) complex formation via ligand exchange between these groups and Cl of cis-Pt(II). In this study, we revealed that the interaction manner of cis-Pt(IV) with endogenous reductants. In the reactions, AsA reduced Pt(IV) to Pt(II) and induced DNA-crosslink formation and DNA oxidation, where HO· was produced; GSH scavenged the radical and interfered with the DNA-crosslink formation. These data strongly indicate the importance of the proper Pt(IV) ligands which are suitable for Pt(IV) reduction by endogenous reductants without complex formation with the generated Pt(II). Citation Format: {Authors}. {Abstract title} [abstract]. In: Proceedings of the 101st Annual Meeting of the American Association for Cancer Research; 2010 Apr 17-21; Washington, DC. Philadelphia (PA): AACR; Cancer Res 2010;70(8 Suppl):Abstract nr 3646.

神経変性疾患との関わりが示唆される生体内カテコールやドパミン（DA）などは、Cuなどの金属との酸化還元反応を介して生体分子を損傷する。本研究では、各種金属（Cu, Hg, Mn, Fe, Pt, Se）とカテコール関連化学物質とによる核酸の酸化損傷・高次構造変化およびそれらが遺伝子発現に及ぼす影響について検討した。また、カテコール誘導体化や新規多核Se化合物によりこれらの損傷を抑制する要件についても検討した。Cu(II)とDAの酸化還元反応は核酸の高次構造変化と酸化損傷を引き起こし、遺伝子発現を阻害した。この阻害はCu(I)特異的キレート剤およびカタラーゼで抑制されるので、Cu(I)およびH₂O₂の関与が考えられる。Hg(II)は単独でも高次構造変化を起こし遺伝子発現を阻害したので、Cu-DAによる高次構造変化を部分的に説明すると考えられる。しかし、Hgはメチル化すると核酸に顕著な変化を与えなかった。Mn(II)はCu(II)とDAによる酸化損傷を増強した。一方、cis-Pt(IV)(NH₃)₂Cl₄は還元物質の共存下で高次構造を変化させ、Fe(III)同様ヒドロキシルラジカルによる酸化的DNA損傷を示した。カテコール環側鎖にα-カルボニル基を導入すると、上記損傷は抑制された。その機構として、金属との錯体形成による酸化還元サイクルの停止がUV, NMR解析などから示唆された。SH化合物とH₂SeO₃の反応により得たSS結合間にSeを複数含む新規多核Se化合物は、酸化的核酸損傷を効果的に抑制した。以上、様々な疾患との関わりが示唆される核酸の損傷が各種金属と化学物質との反応で起こる機構と、それを制御する要件についてその一端が明らかとなった。

金属は一般にDNAに対して高い親和性を持つ。この性質は金属の生体影響を考える上で重要である。職業環境や日常生活での微量だが慢性的な金属への暴露は、発がんや神経変性疾患を引き起こす一因になると考えられているが、これらの疾患の惹起に金属のDNAへの作用がどのように関与するかについては検討の余地がある。複数の酸化数をとる遷移金属のいくつか（Redox metals: Fe, Cuなど）は酸化還元反応を介して生成する活性酸素種（ROS）などがDNAを攻撃すると考えられており、分子機構の詳細解明は現在も続いている。また、非酸化還元性の金属（Non-redox metals: Zn, Hgなど）は、その毒性に酸化ストレスの関与が示唆されているにもかかわらず、直接的にはROSを産生することができない。ミトコンドリアやROS消去系の阻害が関与するとされているが、DNAへの結合が細胞活動に影響することも考えられる。<BR>今回の発表では、各種金属のDNAへの結合とその影響について検討した結果を報告する。ともにRedox metalsであるFeとCuにおいて、DNAを損傷する活性種およびその作用様式に明らかな違いが見られた。両者とも塩基を酸化損傷するが、その過程でCuはDNAの高次構造を変化させることを見出した。これは、Cuの還元にともなうDNAとの配位構造の変化によるものと考えられる。一方、Non-redox metalsではHgがDNAの高次構造を大きく変化させた。塩基損傷など直接的な遺伝情報の変化は引き起こさないものの、DNA複製・転写などに影響すると思われ、Hgの毒性発現機序の一つとして重要な意味を持つ可能性がある。