稲垣 秀一郎

朴葉（朴の木の葉；Magnolia obovata）は抗菌活性やサルモネラ菌の示す毒性に対して抑制効果をもつことが知られている。本研究では、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）のエンテロトキシン（腸管毒素）による腸管細胞（Caco-2）に対する毒性に対して、朴葉が抑制効果を持つことを示した。

先行研究により、米発酵物の特性調査を行ったが、本研究では、新たな糖化微生物種を加えた検討を行った。計13 種の糖化微生物を用いて調製した発酵物の還元糖、グルコース、総アミノ酸、総ポリフェノール含量、および抗酸化活性の比較を行い、用いられた微生物の分類と上記成分および活性値に関係性が見られるかについて考察した。

先行研究によりMucor circinellodesを用いて調製した米発酵物に高い抗酸化活性が認められたことから、本発酵物より抗酸化活性物質の探索を行い、チロソールを同定した。チロソールは、アミノ酸であるチロシンの代謝産物として植物や微生物により生成され、発酵食品等に含まれることが知られている化合物であった。

大豆加工食品製造時に副生する大豆煮汁を6種の大豆発酵食品関連微生物（味噌 や醤油、納豆の製造に用いられる微生物）を用いて純粋培養し、その培養液の酢酸エチル抽出物全てがU937白血病細胞に対して増殖抑制作用を発揮することを示した（米の発酵物には本効果は見られなかった）。また、そのうち醤油麹カビ（Aspegillus sojae）を用いた発酵物ではアポトーシス誘導効果を有することをDNAの断片化試験および顕微鏡観察において明らかにした。さらに、その作用メカニズムとして、カスパーゼ3、8、および9の活性化が関与していることを示した。

The genus Saccharomyces includes industrial yeasts that are used for bread and alcoholic beverage production. Saccharomyces strains isolated from natural resources, referred to as "wild" yeasts, are used for making products with strain-specific flavors that are different from those of the "domesticated" industrial yeasts. The physiological effects of wild yeast are poorly understood. In this study, we isolated 2 Saccharomyces cerevisiae strains (S02 . 03) and 5 Saccharomyces paradoxus strains (P01 . 02, S01, S04 . 05) from natural resources in the Kiso area and investigated the effect of these fungal strains on IgE production by mouse spleen cells. Culturing spleen cells with heat-killed yeasts resulted in elevated IFN-γ and IL-12 levels followed by significant reduction in IgE levels. The S03 and P01 strains induced IL-12 p40 and IL-10 expression in RAW264 cells. Thus, wild strains of S. cerevisiae and S. paradoxus regulate macrophage cytokine production to improve the Th1/Th2 immune balance and suppress IgE production.

In recent years, more effective use of rice has become important because of an annual increase in surplus rice. We fermented rice in pure cultures of eight organisms (Aspergillus oryzae, Monascus pilosus, Absidia corymbifera, Mucor circinelloides, Mucor racemosus, Rhizopus oligosporus, Rhizopus oryzae, and Saccharomycopsis fibuligera), which were isolated from molded rice and soybean products in Asian countries, and evaluated the composition and antioxidant activity of the products. Rice fermented with the two Rhizopus species had a high methanol extract yield, implying good fermentation properties. High saccharification and increased levels of total amino acids and total polyphenols were also found in Rhizopus-fermented rice samples. Ethyl acetate extracts of rice fermented with Ab. corymbifera and Mu. circinelloides had enhanced antioxidant activity compared to unfermented rice, and some fractions obtained from the extracts by high performance liquid chromatography exhibited high antioxidant activity. Based on these results, Ab. corymbifera, Mu. circinelloides, R. oligosporus, and R. oryzae are promising starter organisms for the development of new fermented rice products.

大豆加工食品製造時に副生する大豆煮汁を用いて製造した醸造酢は、ddYマウスを用いた<I>in vivo</I>試験において抗腫瘍活性を有することを示した。また、U937白血病細胞を用いた<I>in vitro</I>試験において、ガン細胞増殖抑制効果およびアポトーシス誘導効果を有することや、活性物質として単離したトリプトフォールは正常白血球細胞に対しては影響を与えないことを示した。さらに、トリプトオフォールは焼酎粕や他の原料を用いて製造した醸造酢にもある一定量含まれることを示した。

大豆加工食品製造時に副生する大豆煮汁から機能性を有する醸造酢を製造する方法について総括した。その中で、<I>in vitro</I>抗腫瘍活性として、本醸造酢の酢酸エチル抽出画分がU937白血病細胞に対して増殖抑制効果およびアポトーシス誘導効果を有すること、また、アポトーシス誘導物質として本醸造酢からトリプトフォールが単離されたこと、さらに、トリプトフォールは酵母がトリプトファンを原料にして生成する代謝産物であることを示した。

日本で市販されている納豆菌株3種（宮城野株、高橋株、成瀬株）とオリジナル株KA-145をIS<I>4Bsu1</I>遺伝子を指標にしてPCR法により識別する手法を確立した。サザンブロット解析により市販納豆菌3種およびKA-145全ての菌株に特有のバンドが検出されたため、インバースPCRおよびシーケンス解析により各菌株に特異的な IS<I>4Bsu1</I>の挿入部位を明らかにした。これらの IS<I>4Bsu1</I>を挟む領域に設計したプライマーを用いてPCRを行い、識別可能であることを確認した。この技術は、納豆製品の差別化のための品質管理に役立つと考えられる。

バイオマスの利活用に関する研究として、大豆煮汁や焼酎粕等の食品産業廃棄物から醸造酢を製造する方法と、加工により付与される機能性について総括した。そのなかで、大豆煮汁を用いて製造した醸造酢にはアポトーシス誘導物質であるトリプトフォールが含まれていること、また、その作用機構としてカスパーゼ3および8が関与していることを示した。さらに、トリプトフォールは大豆煮汁醸造酢のみでなく、トリプトファンを含む原料中で酵母を培養した製造物に共通して含まれることを示した。

In a previous study, we established a method for discrimination of the original natto starter strain, KA-145, of Marumiya Co. Ltd. using IS4Bsu1, though discrimination of commercial natto starter strains was not accomplished. Therefore, we examined a method to discriminate three commercial strains, Miyagino, Naruse and Takahashi strains, as well as the KA-145 strain. Southern blot analysis revealed that Naruse and Takahashi strains have some specific insertion sites of IS4Bsu1 copies. Inverse PCR and sequence analysis further revealed that one of the insertion sites of IS4Bsu1 copy is specific to each strain. Based on the specific IS4Bsu1 locus three primer pairs were designed and PCR was performed to discriminate the four different strains. We also confirmed that one-step multiplex PCR using a mixture of all three primer pairs can easily identify each of the four strains, Miyagino, Naruse, Takahashi and KA-145.

Tryptophol is a natural component isolated from vinegar produced from the boiled extract of black soybean. We have reported that tryptophol induces apoptosis in U937 cells via activation of caspase-8 followed by caspase-3. Tryptophol, however, did not affect human peripheral blood lymphocytes (PBL). In this study, we found that tryptophol enhances formation of a death-inducing signaling complex including death receptor (DR) 5. Cell viability and induction of apoptosis by tryptophol was reduced by transfection with decoy receptor (DcR) 1. These results indicate that tryptophol induces apoptosis through DR5 and that the resistance of PBL to tryptophol-induced apoptosis might be due to competition from DcR1.

大豆煮汁醸造酢に含まれるアポトーシス誘導物質であるトリプトフォールの生成機構について、発酵試験を行うことにより調査した。トリプトフォールは、無添加の最少培地を用いた酵母（醸造酢製造に用いた）の培養液中には検出されなかったのに対し、トリプトファンを添加した最少培地で酵母を培養した際には検出されたことから、本物質は、酵母がトリプトファンを原料にして生成する代謝産物であることを証明した。また、トリプトフォールは大豆煮汁醸造酢のみでなく、焼酎粕や日本酒にも一定量含まれることを示した。

We isolated a novel apoptosis-inducing component, tryptophol, from vinegar produced from boiled extract of black soybean (black soybean vinegar). Compound-6 purified from an ethyl acetate extract of black soybean vinegar using high performance liquid chromatography (HPLC) induced fragmentation of DNA and the development of apoptotic bodies (characteristic physiological features of apoptosis) in U937 cells. By analysis of chemical structure, this active compound was identified as tryptophol. Tryptophol induced apoptosis involving caspase-8 and -3 activation, followed by cleavage of poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), as shown by measurement of enzyme activity and immunoblot analysis. The cell viability of normal lymphocytes separated from human blood was less affected by tryptophol, and fragmentation of DNA was not induced in normal lymphocytes. These results indicate that tryptophol isolated from black soybean vinegar inhibited the proliferation of U937 cells by inducing apoptosis via a pathway involving caspase-8 followed by caspase-3, without affecting normal lymphocytes.

大豆加工食品（納豆や味噌、醤油）を製造する過程で副生する大豆煮汁を原料に用い、麹を添加後、酵母によるエタノール発酵および酢酸菌による酢酸発酵を経て醸造酢を製造する方法を確立した。本研究では、異なる麹を用いた際の製造物の嗜好性の調査や、大豆煮汁の発泡性に及ぼすエタノール発酵の影響、製造過程におけるタンパク質の分解度を調査した。また、<I>in vitro</I>生理活性評価により抗酸化活性、ACE阻害活性、およびAGE生成抑制効果を有することを示した。

The effect of vinegar produced from the boiled extract of black soybeans on apoptosis induction in human monoblastic leukemia U937 cells was investigated. The boiled extract of black soybeans obtained from a natto (traditional Japanese fermented soybean product) factory was employed as a novel raw material for vinegar production. An ethyl acetate-soluble fraction of this vinegar (EBV fraction) was shown to strongly suppress cell proliferation of U937 cells. Fragmentation of DNA and morphological changes showing apoptotic bodies, which are characteristic of apoptotic cell death, were observed in U937 cells treated with 10 mg/ml of the EBV fraction. Flow cytometry analysis using an Annexin-V-FLUOS Staining Kit confirmed that cell death was due to apoptosis. On the other hand, the cell viability of lymphocytes separated from human blood was less affected by the EBV fraction,and fragmentation of DNA was not induced. These results suggest that the EBV fraction exerted cell toxicity via apoptosis in U937 cells but not in normal lymphocytes.

A flavorful vinegar was produced from boiled soybean extract by ethanol fermentation using koji and yeast followed by acetic acid fermentation using the supernatant of ethanol-fermented mash with addition of Acetobacter aceti IFO 3283. The results of sensory tests on the vinegar produced showed that rice koji for miso paste production and sake yeast Saccharomyces cerevisiae kyokai No. 77 were the most suitable ingredients for the production of vinegar from boiled soybean extract. Foaming in the fermented mash during acetic acid fermentation was found to decrease when the supernatant of ethanol-fermented mash was used. It seemed that this was caused by the degradation of saponin in the boiled soybean extract by enzymes of koji and yeast. The vinegar produced from boiled soybean extract showed radical-scavenging activity and inhibition of angiotensin I converting enzyme in vitro.

某納豆会社のオリジナル納豆菌株であるKA-145株と他の納豆菌株をPCR法により識別する手法を確立した。数種の納豆菌のうち、KA-145株特異的に挿入されている IS<I>4Bsu1</I>が存在ことをサザンブロット解析により明らかにした。また、インバースPCRおよびシーケンス解析により挿入領域を特定した。挿入されている IS<I>4Bsu</I>1を挟む領域に設計したプライマーを用いてPCRを行うことでKA-145株特異的なバンドが増幅されることを確認することにより、識別可能と判断した。

The potential sensitivity of liver specific protein regucalcin as a biochemical marker of chronic liver injury with carbon tetrachloride ( CCl4) administration in rats was investigated. CCl4 (10%; 1.0 ml/100 g body wt) was orally given 5 times at 3-day intervals to rats, and the animals were killed by bleeding at 3, 6, 18, and 30 days after the first administration of CCl4. The body weight of rats was significantly lowered 3 and 6 days after CCl4 administration as compared with that of control rats administered with corn oil, and then the weight was restored at 18 and 30 days. Serum glutamate-oxaloacetate transaminase ( GOT) and glutamate-pyruvate transaminase (GPT) activities were significantly increased 3 days after the administration, while a significant increase in serum gamma-glutamyltranspeptidase (gamma-GTP) activity was seen at 3 and 6 days after the administration. Serum GOT, GPT, and gamma-GTP activities were restored to control levels at 18 and 30 days after CCl4 administration. Serum albumin, alpha-fetoprotein, and ammonium levels were not changed by CCl4 administration. Meanwhile, serum regucalcin concentration was markedly increased 3 and 6 days after CCl4 administration, and a significant increase in serum regucalcin concentration was observed 18 and 30 days after the administration. Liver regucalcin mRNA and liver cytosolic regucalcin levels were significantly decreased 18 and 30 days after CCl4 administration. Liver content of calcium, which intracellular calcium homeostasis is maintained, was significantly increased between 3 and 30 days after CCl4 administration. Hepatic mitochondrial succinate dehydrogenase activity was significantly increased 30 days after the administration. The present study demonstrates that serum regucalcin has a potential sensitivity as a specific biochemical marker of chronic liver injury with CCl4 administration in rats.

プロテインキナーゼ活性は細胞増殖に深く関わっていることが知られているが、肝ガン細胞（H4-Ⅱ-E）においても、プロテインキナーゼ抑制剤の培地への添加によって細胞増殖が抑えられた。また、培地中への抗レギュカルチン抗体の添加によってプロテインキナーゼ活性および細胞増殖は促進された。これらの結果から、レギュカルチンはプロテインキナーゼ活性を阻害することで H4-Ⅱ-Eの細胞増殖を抑制していることが示唆された。

肝ガン細胞（H4-Ⅱ-E）の培養液中にカルシウム結合タンパク質であるレギュカルチンに対する抗体を添加することにより、 H4-Ⅱ-EのDNAの合成が活性化されるとともに細胞の増殖が促進された。また、培地中へのレギュカルチンの添加はDNAの合成を阻害し、細胞の増殖を抑制した。さらに、種々のカルシウムシグナル抑制剤の添加によってもDNAの増殖および細胞増殖が抑制されることを確認した。これらの結果から、レギュカルチンは細胞のDNA合成を阻害することで肝ガン細胞の増殖を抑制していることが示唆された。

カルシウム結合タンパク質であるレギュカルチンを過剰発現させた肝ガン細胞株（RC/H4-Ⅱ-Eトランスフェクタント）では、通常の H4-Ⅱ-E細胞 に比べてDNAの合成および細胞増殖が著しく低下した。また、培地への抗レギュカルチン抗体の添加により RC/H4-Ⅱ-Eトランスフェクタントの増殖は促進された。このことから、レギュカルチンが肝ガン細胞の DNAの合成および細胞増殖に深く関与しているというこれまでの報告を、その高発現細胞株を構築することによりサポートした。

肝ガン細胞（H4-Ⅱ-E）の培養液中にカルシウム結合タンパク質であるレギュカルチンを添加することにより、細胞内のプロテインチロシンホスファターゼの活性が阻害され、また、細胞増殖が抑制された。本現象は抗レギュカルチン抗体を添加することにより回復することから、レギュカルチンは、H4-Ⅱ-Eの増殖に関与するプロテインチロシンホスファターゼの活性を阻害することによりガン細胞増殖を抑制していることが示唆された。